PicoTwist單分子操縱磁鑷裝置

于傳統(tǒng)的單分子操縱技術(shù)—微針、原子力顯微術(shù)、光鑷等存在作用力小且不易測量、實驗環(huán)境受限制、對生物樣品有損害等諸多不足。作為克服這些不足而出現(xiàn)的磁鑷技術(shù)，具有作用力大、應(yīng)用范圍廣、無損耗、穩(wěn)定等優(yōu)勢，很好得解決了這些問題。磁鑷提供的作用力在大小內(nèi)可調(diào)，既可從分子外部進(jìn)行操作，也可以深入細(xì)胞內(nèi)部，還可對溶液體系中的鮮活樣品進(jìn)行操作.

PicoTwist磁鑷裝置是基于專用的倒置顯微鏡，安裝在電動平移和旋轉(zhuǎn)平臺的一套強大的單分子操縱磁鑷裝置。PicoTwist磁鑷裝置的原理是通過梯度分布的磁場對處于其中的可磁化小珠施力， 觀察并分析其運動。該磁鑷裝置使用一對強大的稀土磁鐵 （BdFeB）來使磁珠磁化強度能夠達(dá)到飽和值。由于應(yīng)用了高精度的溫度控制裝置、特殊的樣品固定裝置、保證磁珠快速旋轉(zhuǎn)的步進(jìn)電機和靈活管理的計算機軟件系統(tǒng)以及萬像素的CCD相機，可以同時實現(xiàn)多達(dá)40個單個分子的視頻采集和跟蹤測量，大大提單分子的高通量分析和統(tǒng)計水平。

圖1 PicoTwist單分子操縱磁鑷裝置

系統(tǒng)亮點概述
（1）極其穩(wěn)定健壯—PicoTwist單分子操縱磁鑷裝置具有非常低的圖像漂移設(shè)計
納米操縱的主要障礙之一是顯微鏡圖像漂移，造成檢測信號誤差。納米操縱實驗通常會在一秒到幾天時間內(nèi)對DNA、蛋白質(zhì)等進(jìn)行分析，并精確記錄和跟蹤DNA 、蛋白質(zhì)等分子的構(gòu)象變化。一般的顯微鏡并非為長時間觀測納米尺寸的物體而設(shè)計，所以無法在在納米精度下記錄物體的位置。一般情況下，機械漂移是由溫度變化引起，但大多數(shù)顯微鏡制造商并不說明物體在一攝氏度溫度變化范圍內(nèi)所引起的圖像漂移幅度。一般的顯微鏡因為溫度變化所引起的圖像漂移誤差較大，通常每°C溫度變化引起1um的漂移幅度。這會引起顯微操縱的失真，因為只要1/100 °C的變化就足以導(dǎo)致所觀測物質(zhì)10 nm 的位置變化。
PicoTwist單分子操縱磁鑷裝置具有非常低的圖像漂移設(shè)計。其裝置溫度控制精度高，樣品在10至55°C范圍內(nèi)，可精確控制和監(jiān)測1 / 100°C的變化。PicoTwist磁鑷裝置1°C的溫度變化引起的漂移通常只有30nm（比標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡小30倍）；而目標(biāo)的焦點位置設(shè)置在250um范圍內(nèi)，無滯后效應(yīng)，所以有效提高了單分子的測量準(zhǔn)確性。

圖2一般商業(yè)顯微鏡和PicoTwist
經(jīng)歷相同的熱環(huán)境過程中焦點位置漂移的比較

（2）高分辨率、力的范圍廣—具有非常薄的樣品固定裝置
為了實現(xiàn)強大的磁力，磁鐵需要放置在非?？拷胖榈奈恢谩icoTwist設(shè)計了一個特殊的固定裝置，以使磁鐵與磁珠的距離最小可以達(dá)到100um。樣品固定裝置是一種三明治結(jié)構(gòu)組成，其中最上層是蓋玻片，中間層是微通道雙面膠帶，底部則是一個薄的聚酯薄膜片。該聚酯薄膜片比最上層是蓋玻片要長一些，以保護(hù)和平移上面的顯微鏡物鏡。

圖3 PicoTwist樣品固定裝置

(3)可以同時實現(xiàn)多達(dá)40個單個分子的視頻采集和跟蹤測量，大大提單分子的高通量分析和統(tǒng)計水平。

(4)使用一對強大的磁鐵來控制 DNA 伸展和超螺旋
磁鑷的原理是通過梯度分布的磁場對處于其中的可磁化小珠施力， 觀察并分析其運動。磁珠受力直接取決于外磁場，所以磁鑷系統(tǒng)的磁感應(yīng)強度要足夠大，使磁珠磁化強度能夠達(dá)到飽和值，而磁場分布也要有合適的梯度。PicoTwist使用一對強大的磁鐵來控制 DNA 伸展和螺旋。一對稀土磁鐵——釹鐵硼磁鐵（BdFeB） 產(chǎn)生一個很強的磁場梯度非常強，其中磁場是水平的，而磁場梯度是垂直的。磁鐵磁極之間的孔隙為顯微鏡照明提供了光路。
當(dāng)?shù)诙姍C驅(qū)動磁鐵圍繞垂直軸旋的時，磁場方向根據(jù)磁極的旋轉(zhuǎn)而旋轉(zhuǎn)，但磁場梯度保持不變，因此磁鐵可以在保持角方向拉伸力不變的情況下的旋轉(zhuǎn)磁珠，其表現(xiàn)像指南針在磁場中轉(zhuǎn)動。第二電機驅(qū)動磁極自轉(zhuǎn)速率約為每秒10圈，幾乎與最有效的分子泵相同。裝置中磁珠的旋轉(zhuǎn)角度和拉伸力都通過相同的軟件包來控制，可以通過快速改變控制參數(shù)實現(xiàn)不同反應(yīng)條件下的測試。

圖4 PicoTwist磁極控制磁珠過程示意圖

（5）并行的照明和攝像頭
PicoTwist磁鑷裝置的另一獨特的和強大的功能是它能夠?qū)崟r測量磁珠的Z軸（垂直）位置。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，顯微鏡照明光源為高亮度發(fā)光二極管發(fā)射的平行光束。在這種條件下，磁珠圖像產(chǎn)生一系列的衍射環(huán)，其形狀和數(shù)量經(jīng)常變化可通過軟件來評估散焦圖像種磁珠的z軸位置。裝置中的LED照明光源非常穩(wěn)定。且易于調(diào)節(jié)光源的空間相干性以得到清晰的環(huán)形圖案。并且LED照明光源功率非常低，避免了對觀測過程產(chǎn)生雜散效應(yīng)的干擾。
在觀測過程中，磁珠的圖像通過一個快速CCD相機耦合到顯微鏡獲得。該標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)備使用768 ×576像素，60 Hz攝像機，或者使用1380 × 1040像素，31 Hz攝像機。

圖5 通過磁珠圖像產(chǎn)生衍射環(huán)來計算磁珠的z軸位置
（6）配備磁珠跟蹤軟件，可實時進(jìn)行數(shù)據(jù)分析
磁珠跟蹤軟件由PicoTwist設(shè)計，可實時進(jìn)行磁珠的納米級分辨率的跟蹤和定位。通過基于PC的計算機輔助電視顯微鏡系統(tǒng)，點擊感興趣的磁珠的圖像，用戶開始跟蹤磁珠的運動過程，并確定磁珠運行實時的三維位置。使用相關(guān)算法來分析磁珠的圖像，不管它是明亮還是較暗，都可以得到高精度的X，Y位置信息。通過計算磁珠的產(chǎn)生衍射環(huán)圖像，并計算每個視頻幀中的變化，可以得到納米精度分辨率的磁珠Z軸位置信息。
同時，該軟件能夠同時跟蹤幾個磁珠。正是由于該系統(tǒng)可以跟蹤感興趣的磁珠以及粘在玻璃表面的參考磁珠，所以通過執(zhí)行差分跟蹤，來實現(xiàn)殘余漂移效應(yīng)的去除。同時，磁珠的作用力和作用角度可以隨意調(diào)節(jié)，磁珠的3D位置信息也可以在實驗的幾小時，幾天甚至幾個星期中被連續(xù)測量。

圖6 磁珠跟蹤軟件工作界面
3、適用范圍
生物單分子研究將成為 21 世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域的一個重點研究方向，在生命科學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。磁鑷是單分子研究的一種方法，PicoTwist單分子操縱磁鑷裝置通過磁場控制超順磁性小珠的移動，然后用這個小珠捕捉單分子，并進(jìn)行相關(guān)的力學(xué)實驗。其主要的應(yīng)用范圍包括：

1.在單分子水平上對生物分子行為(包括構(gòu)象變化、相互作用、相互識別等)的實時﹑動態(tài)檢測以及在此基礎(chǔ)上的操縱﹑調(diào)控等；

2.對單個生物大分子施以力或力矩，并測量它們的物理性質(zhì)(如DNA彈性、蛋白質(zhì)的力學(xué)變性等)

3.對單個生物大分子施以力或力矩，測量它們的力學(xué)生化反應(yīng)(如分子馬達(dá))；

4.研究機械力的作用如何影響細(xì)胞的生長、分裂、運動、粘附以及信號的傳輸，基因的表達(dá)；

5.在生物大分子上施加力以使之發(fā)生構(gòu)像上的變化，研究生物單分子形成新的結(jié)構(gòu)，以及力學(xué)以及動力學(xué)之間的相互聯(lián)系等。

6.研究各種藥物可能導(dǎo)致的DNA、蛋白質(zhì)凝聚、變性過程；

7.給出分子實時行為與性質(zhì)的分布，有效避免對集群測量苛刻的同步(synchronization)要求，如DNA的解鏈(unzipping)、蛋白質(zhì)的折疊(folding)等。

8.更多的科研Idea………

4、參數(shù)

1. 磁鑷主要包括磁路系統(tǒng)、顯微成像系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)等部分。作用力量程(pN)：0.01 pN—100 pN

2. 樣品溫度控制范圍：14°C- 55°C

3. 溫度控制精度：1 / 100°C

4. 圖像漂移控制精度：20分鐘內(nèi)小于30 nm

5. 高速實時測量速度：>60 Hz

6. CCD相機參數(shù)：使用768 ×576像素，60 Hz攝像機；或者使用1380 × 1040像素，31 Hz攝像機

7. 樣品固定裝置磁鐵與磁珠的最小距離：≥ 100um

圖7 PicoTwist部分組件的參數(shù)
5、使用方法
樣品（如DNA）的一端連接在直徑1um的超順磁性小球上，另一端連接在樣品固定裝置中的玻璃表面上。兩塊釹鐵硼磁鐵置于樣品上方，當(dāng)移動磁鐵接近樣品時，通過超順磁性小球給樣品施加皮牛級的拉力，同時旋轉(zhuǎn)小磁鐵可以向樣品施加扭轉(zhuǎn)應(yīng)力.小球的位置通過一臺倒置顯微鏡以大于60Hz的采樣頻率記錄. 測量樣品，如DNA 的力拉伸曲線、DNA長度與小磁鐵旋轉(zhuǎn)圈數(shù)關(guān)系曲線、計算得到DNA 超螺旋結(jié)構(gòu)，形成DNA超螺旋閾值處的結(jié)合和解離動力學(xué)等。

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附件：
現(xiàn)在已經(jīng)有很多單分子的操縱技術(shù)：原子力懸臂、光鑷、磁鑷以及流場拖曳、生物膜力探針(BFP)等。在這些實驗中，生物分子的一端固定于一表面，另一端與力傳感器相連。

表 1 各種生物單分子實驗技術(shù)的比較

圖1 力傳感器的示意圖
A. AFM 實驗示意圖，懸臂用來作分子間力作用的傳感器，懸臂的位移由激光束獲得;
B. 光學(xué)纖維作力傳感器的例子;

C. 光鑷的示意圖；

D. 磁鑷示意圖。