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Qioptiq 光源推動PCR技術(shù)研發(fā)

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淺談數(shù)字PCR

引言

近來，新冠肺炎的疫情牽動著人們的心，在醫(yī)療工作中快速、準(zhǔn)確的確診感染者和判斷患者康復(fù)情況至關(guān)重要。社會大眾對于新冠病毒PCR核酸檢測的準(zhǔn)確性、有效性也頗為關(guān)心，那么到底什么是PCR核酸檢測呢？

PCR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù), polymerase chain reaction），是通過模擬體內(nèi)的DNA復(fù)制方式，在體外有選擇性地將特定基因（或DNA序列）擴(kuò)增，使得樣本中原本數(shù)量極少的特定基因數(shù)量變得足夠龐大，從而能夠被光學(xué)法或其他體外診斷方法檢測出來。

PCR反應(yīng)過程主要為三步：變性、退火和延伸。變性是通過加熱使DNA雙鏈打開形成單鏈。然后退火降溫，溫度降低后加入的引物會與DNA中互補區(qū)相結(jié)合。最后的延伸過程，在DNA聚合酶作用下，聚合酶催化引物延伸，合成出于DNA新鏈。以上的三個步驟為一個循環(huán)，通過不斷的循環(huán)半保留復(fù)制，一個DNA分子就會被復(fù)制成無數(shù)個同樣的DNA分子。

圖1 PCR反應(yīng)過程

以上步驟完成了特定基因的擴(kuò)增，后續(xù)就是對擴(kuò)增基因的檢測。目前最為主流的檢測方法是熒光光學(xué)法，熒光PCR (qPCR)是第二代PCR技術(shù)，就是在PCR反應(yīng)過程中加入熒光基團(tuán)，通過直接測量激發(fā)后的熒光光信號強弱，從而實時、定量地檢測樣本中的特定基因。

熒光PCR因其簡便、安全、非接觸式的優(yōu)點，得到了非常廣泛的應(yīng)用。然而熒光PCR也有自己的缺陷，其依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和參考樣本、難以精確測定基因拷貝數(shù)、精確度也有不足的問題。這也是此次新冠疫情中，一些專家建議在核酸檢測的同時，參考胸片CT影像綜合診斷的原因。針對這些情況，能夠絕對定量的第三代PCR技術(shù)——微滴式數(shù)字PCR技術(shù)(Droplet Digital PCR, DDPCR)顯然具有更廣闊的應(yīng)用前景。

圖2 qPCR典型原理圖

 

什么是微滴式數(shù)字PCR？

 

微滴式數(shù)字PCR是一種基于PCR反應(yīng)的單分子絕對定量技術(shù)。原理是將含有核酸模板的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系，平均分配為數(shù)以萬計的微液滴，盡可能使得每個反應(yīng)中含有一個模板，然后進(jìn)行單分子模板的PCR反應(yīng)。這樣含有模板的液滴在擴(kuò)增后就會具有較強的熒光，依次測量每一個微液滴讀取熒光信號，再針對熒光信號的有無計數(shù)就可以實現(xiàn)絕對定量。

圖3 微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)過程

dPCR通過對樣本的微滴化處理，大大提升了測量的靈敏度和準(zhǔn)確性，只需要非常少的模板量就能夠進(jìn)行檢測。此外，dPCR還彌補了qPCR系統(tǒng)需要嚴(yán)格依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的問題，測量絕對定量，對逐個微液滴的統(tǒng)計分析結(jié)果可靠。在實際應(yīng)用中，dPCR還具備防污染和全集成的優(yōu)點。PCR反應(yīng)被嚴(yán)格局限于水相微液滴中，能夠有效避免接觸污染，也易于集成和自動化。

數(shù)字PCR的檢測靈敏度較熒光定量PCR高1-2個數(shù)量級，更適合檢測微量痕量病毒，此次冠狀病毒感染也出現(xiàn)了早期癥狀不明顯、但核酸檢測呈陽性的的“潛在感染者”和“隱藏患者”。

借用一個例子，qPCR檢測突變像是在大海里撈一個會發(fā)光的針，周圍都是海水，很難看到針的光在哪，而dPCR就像把海水盛到好多個碗里面，瞧一眼很容易就知道哪個碗在發(fā)光了，而且，系統(tǒng)還會數(shù)出來到底有多少個碗里是發(fā)光的，多少個碗里是沒發(fā)光的，這樣一比，就很容易的知道有多少數(shù)量的突變，就能做到絕對定量了。

一句話概括：微滴式數(shù)字PCR：“數(shù)(shǔ)數(shù)(shù)”

 

微滴式數(shù)字PCR的熒光檢測方法

 

dDPCR的熒光檢測主流方法主要有兩種，一種是以QuantStudio? 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)為代表的微流控芯片加工法，另一種則是以Bio-rad QX200為代表的微滴法。這兩個產(chǎn)品也是目前國內(nèi)三級醫(yī)院所使用的數(shù)字PCR主流產(chǎn)品。

QuantStudio? 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)基于高密度的微流控芯片，將樣品均勻分布到多達(dá)20000個微孔中相互隔離。PCR反應(yīng)后，通過高亮度LED光源激發(fā)熒光信號，使用冷CCD進(jìn)行檢測，再讀取每個微孔的信號進(jìn)行計數(shù)。

圖4 基于微流控芯片技術(shù)的數(shù)字PCR

Bio-rad QX200則是借助了微滴技術(shù)和微流體技術(shù)，借助微滴發(fā)生器生成20000個均一的微滴，經(jīng)PCR反應(yīng)后再將液滴吸入管路依次通過一個雙色光學(xué)檢測系統(tǒng)，再檢測陽性和陰性的微滴數(shù)量。

 

圖5 微滴式數(shù)字PCR典型檢測光路

圖5為一種典型的流式裝置光路布局：布置在側(cè)面的激發(fā)光源產(chǎn)生的激發(fā)光，經(jīng)二色鏡反射并聚焦到微液滴流道上，微液滴在流道中依次排列一個個地通過聚焦位置，每個微液滴依次被照射產(chǎn)生激發(fā)熒光。熒光在被布置在下方的探測器收集，經(jīng)過光電器件轉(zhuǎn)變?yōu)橐子谔幚砗头治龅碾娦盘枴?/font>

QuantStudio? 3D之流的熒光成像法有幾個優(yōu)點。

首先，可以高通量地檢測到帶有熒光信號的液滴，在一張圖像中可以同時檢測到數(shù)千個液滴。通過獨特的廣角鏡頭，甚至可以同時檢測到100萬個液滴。

其次，光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計相對簡單明了，甚至傳統(tǒng)的數(shù)碼單反相機(jī)都可以用來進(jìn)行熒光成像。

第三，通過在多路檢測中添加多個熒光濾光片，可以方便地實現(xiàn)多色熒光成像。

然而，由于光源的穩(wěn)定性變化和相鄰液滴間的熒光信號干擾，使得熒光成像的檢測靈敏度和動態(tài)范圍受到限制。

Bio-rad采用的激光誘導(dǎo)熒光(laser-induced fluorescence, LIF)細(xì)胞計數(shù)法，在LIF中，液滴經(jīng)過流式光路檢測，以每秒數(shù)百至數(shù)千液滴的速度檢測熒光信號。并且LIF檢測可以加上光學(xué)共焦檢測模塊，入射激光和發(fā)出的熒光信號分別通過針孔，通過抑制非焦平面的光學(xué)噪聲來提高信噪比。

LIF流式檢測可以獲得更高的靈敏度和動態(tài)范圍。然而，與熒光成像系統(tǒng)相比，LIF光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計相對復(fù)雜。不過對于臨床應(yīng)用來說，高靈敏度的熒光檢測對于ddPCR獲得可靠、準(zhǔn)確的患者標(biāo)本診斷結(jié)果至關(guān)重要。

 

微滴式數(shù)字PCR的激發(fā)光源選型

實際應(yīng)用中，因為微液滴尺寸非常小，單個微液滴的直徑僅約幾十微米，且在流道內(nèi)高速流動，往往單個液滴接收到激發(fā)光照射的時間不到1微秒。這就要求激發(fā)光源發(fā)出的激發(fā)光必須在很短的時間內(nèi)，使得聚焦位置達(dá)到足夠的光照強度，因此激發(fā)光必須同時具備光強度高、穩(wěn)定性好的特點，因此最好采用高穩(wěn)定激光器作為激發(fā)光光源。

此外，因為微液滴大小的限制，激光器本身的指向穩(wěn)定性、功率穩(wěn)定性和噪聲也有要求。

 

流式光路設(shè)計

來自英國的Qioptiq公司（EXCELITAS集團(tuán)）是一家提供高端光子解決方案的供應(yīng)商，有著齊全的光源、光學(xué)/電子學(xué)和探測器等產(chǎn)品線和很強的OEM能力，可以從零開始在短時間內(nèi)設(shè)計和定制流式細(xì)胞儀等復(fù)雜光學(xué)儀器光路解決方案。對于PCR系統(tǒng)中流式光路部分，可以為定制者提供靈活可用的方案。這是一個省心并高效的選擇，在生命科學(xué)分析儀器中，可以兼顧廠商往往極為關(guān)心穩(wěn)定性和實效性。

圖6  四通道流式原型機(jī)，從草圖到原型機(jī)僅用時8周。所有主要產(chǎn)品均來自EXCELITAS

（組件：1、兩臺配有光纖的Qioptiq iFLEX-iRIS?固態(tài)激光器；2、六個Excelitas LynX? SIPM探測模塊3、Qioptiq kineMATIX?光纖耦合器4、Qioptiq OPTEM顯微物鏡5、LINOS Microbench和軌道系統(tǒng)）

采用的的iFLEX系列激光器是一系列低噪聲、高穩(wěn)定的激光器，具備功率高度穩(wěn)定、光束指向穩(wěn)定性優(yōu)異、超低噪聲，非常適合作為微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)的激發(fā)光源。直接搭配合束及整形輸出，可以將光路最簡化，以便盡量消除流式光路中各種潛在的光噪聲干擾。迷你的光纖激光模塊擁有即插即拔的KineFLEX專利技術(shù)，可以確保極端的穩(wěn)定性。

圖7 定制的流式光路產(chǎn)品：雙波長激光器光纖合束整形輸出所需光斑（約20*80μm）

 

“將高可靠性的激光源集成到OEM系統(tǒng)中，從而實現(xiàn)極致精度和照明性能?！?/span>

無限插拔的合束/分束/耦合光纖系統(tǒng)，可以讓光路更簡化、穩(wěn)固、便捷設(shè)計。